质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳——万融实验

更新日期:2025-06-08 00:15

写作核心提示：

作文题目：质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳实验注意事项
一、引言
质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳实验是分子生物学研究中常用的一种技术，对于基因克隆、基因表达、基因测序等研究具有重要意义。为了确保实验结果的准确性和可靠性，以下是在进行该实验时应注意的几个事项。
二、实验注意事项
1. 实验器材准备
（1）确保所有实验器材干净、无污染，如移液器、吸管、培养皿、离心管等。
（2）实验前检查仪器设备是否正常，如电泳仪、紫外灯、离心机等。
2. 实验试剂准备
（1）严格按照试剂说明书配制试剂，注意试剂的浓度和pH值。
（2）实验过程中，尽量避免试剂的交叉污染，如使用专用移液器、吸管等。
3. 操作步骤
（1）实验操作要轻柔，避免对细胞造成损伤。
（2）在操作过程中，尽量减少DNA的暴露时间，防止DNA降解。
（3）在提取DNA时，注意避免使用高温、剧烈振荡等条件，以免破坏DNA结构。
4. 电泳条件
（1）电泳前，确保凝胶质量良好，无气泡、杂质等。
（2）电泳过程中，注意控制电流和电压，避免过大的电流和电压导致DNA断裂。
（3）电泳

质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳——万融实验

一、碱变性法提取质粒

DNA质粒（plasmid）是细菌染色体外能自主独立复制的双股环状DNA，带有遗传信息，可赋予细菌某些新的性状。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。分离和纯化质粒DNA的方法很多，但这些方法基本包括三个步骤，即细菌的培养和质粒DNA的扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的提取与纯化。本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。

【实验原理】

细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙啶（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。

【实验材料与仪器】

1.菌株　E.coliJM109（pUC19），E.coli RRI（pBR322）。

2.试剂　溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·HClpH8.0，10mmol/LEDTA）；溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH，1％SDS），用前新配制；溶液Ⅲ（3mol/LKAc溶液pH4.8）；TE缓冲液（10mmol/LTris·HCl，1mmol/LEDTApH8.0）；LB液体培养基（胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加蒸馏水溶解，用NaOH调pH至7.5，加水至1000ml，103.46kPa高压灭菌15min）。

【实验方法】

1.接种细菌于5mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。

2.3000r/min离心15min，弃上清。加入100μl溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。

3. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，颠倒E P管5次，混合均匀，置冰浴2min。

4.加入150μl溶液Ⅲ，温和地混匀，12000r/min离心5min。

5.吸取上清液放入另一新EP管中，加等体积酚－氯仿－异戊醇抽提2次，12000r/min离心2mi n（若不做酶切，此步可省略）。吸取上清放入另一新E P管中，加入二倍体积的冷乙醇，12000r/min离心10min。6.弃乙醇，干燥后用30μlTE缓冲液洗下核酸，待电泳检测。

二、琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

琼脂糖凝胶电泳技术（agarose gel electroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率取决于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辨0.1～6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用，它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙啶（EB）能与双链DNA结合的特性，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。

【实验材料与仪器】

1.琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mmol/LTris，20mmol/LNaAc，1mmol/LEDTApH8.0）。

2.载体缓冲液（0.25％溴酚蓝，30％甘油）、溴化乙啶水溶液（10mg/ml）。3.梳子、电泳槽、电泳仪、变压器等。

【实验方法】

1.取琼脂糖0.9g，加入100ml1×TAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，加热溶解。

2.平衡放置电泳槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5～1mm）。3.铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙啶水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5～8mm。

4.待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液（0.5×TAE电泳缓冲液）的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2～3mm，小心拔出梳子。5.DNA样品与载体缓冲液5∶1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。

6.打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5V/cm。

7.据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的泳动距离在5SRNA和0.3kbDNA带之间）。

8.电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。

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